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crispr|《科学》深度综述：CRISPR-Cas指引基因工程的未来

▎药明康德编译整理（来源：《科学》）
2018年，顶尖学术期刊《科学》推出了“变革生物学的技术”特刊，为我们详细介绍了数种目前正在给生物学领域带来革新的重磅技术 。在此CRISPR-Cas基因编辑系统斩获诺奖之际，药明康德内容团队在这篇文章中，也将与各位读者朋友们重温其中关于CRISPR-Cas的内容，一道展望它能如何指引基因工程的未来 。
CRISPR-Cas基因编辑系统的多样性、模块性和高效性正在掀起一场生物技术革命 。RNA指导的Cas酶已经被用来作为在培养细胞，动物和植物中操纵基因组的工具 。它不但加快了基础研究的步伐，而且让临床和农业突破成为可能 。CRISPR-Cas基因编辑系统的鼻祖之一、加州大学伯克利分校的Jennifer A. Dounda博士和她课题组的Gavin J. Knott博士在《科学》杂志上撰文，对这一技术的优势、进化趋势和应用进行了盘点 。
crispr|《科学》深度综述：CRISPR-Cas指引基因工程的未来
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▲CRISPR-Cas系统的各种应用（图片来源：《科学》）
使用dCas9调控转录过程
Cas9是一个模块式的平台，它的DNA结合能力和核酸酶活性分属不同的模块 。通过在Cas9核酸酶蛋白域引入突变，可以生成催化活性缺失的Cas9（dCas9） 。它可以成为募集蛋白的骨架，在干扰特定位点转录过程时不会对DNA产生永久的影响 。使用dCas9为功能性基因筛检带来革命性的变化，因为它让在多种细胞中进行迅速，特异性，高通量的基因敲低成为可能 。这些研究进展凸显出在操作基因组的同时不引入永久性DNA损伤的实用性 。例如，将dCas9与TET1（一种去甲基化酶）融合，可以在脆性X综合征（fragile X syndrome）神经元和小鼠模型中靶向失调的FMR1位点，并且逆转表型 。
使用靶向RNA的Cas在转录后进行基因工程
与产生永久基因变化相对，Cas效应子可以通过靶向RNA对转录组进行暂时干扰 。利用呈现PAM序列的寡核苷酸，Cas9系统可以被改造成可编程的RNA编辑工具（RCas9） 。RCas9可以用于消除致病RNA，修复mRNA剪接错误，或者降低三核苷酸重复序列表达的蛋白水平 。目前获得的成功表明，Cas9可能在转录后基因工程领域大有作为，例如与单碱基RNA调控子融合来实现对特定RNA位点的调控 。
【crispr|《科学》深度综述：CRISPR-Cas指引基因工程的未来】Cas13是靶向RNA领域最新涌现的多功能工具 。Cas13a系统是一个RNA指导的核糖核酸酶（RNase），它可以在哺乳动物和植物体内用于有特异性地敲低RNA 。与Cas13a功能和进化相似的Cas13b具备可编程的RNase活性，它已经被用于在哺乳动物细胞中实现RNA干扰和RNA编辑 。Cas9和Cas13靶向RNA的系统除了支持基础研究以外，在临床上可以达到和反义寡核苷酸疗法相似的临床应用，在不产生永久性遗传变化的情况下，治疗急性非孟德尔疾病（acute Mendelian patholgies) 。
可编程核酸成像
对于特定基因组位点，mRNAs，和非编码RNAs来说，在细胞中的特定时空分布对它们的功能至关重要 。将dCas9与荧光报告基因融合在一起，研究人员已经能够对基因组中的重复位点在活细胞中进行成像 。然而，限制dCas9在基因组特定位点分布研究中应用的原因是，对于非重复序列，这一手段的信噪比较低 。克服信噪比不足的一个方法是在sgRNA上附加多个MS2序列，这些MS2序列能够与MS2序列结合蛋白相结合，而将MS2序列结合蛋白与荧光蛋白融合在一起，则能够有效地增强信号强度 。使用靶向RNA的RCas9让研究人员能够在活细胞中追踪RNA，从而让追踪携带重复扩增序列的RNA成为可能，这具有重要临床意义 。
核酸检测和诊断
在Cas13a和Cas12a中RNA指导的核酸酶活性促进了创新核酸检测工具的研发 。对于Cas13和Cas12a来说，靶点核酸通过与指导RNA的碱基配对，会激活普通的核酸酶活性 。利用这种可控的核酸酶活性，Cas13被用于从大量RNA中检测特定RNA序列的存在 。基于这一研究开发出的SHERLOCK技术平台，能够同时检测出登革热和寨卡病毒的单链RNA的存在 。

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